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百花齐放,2016单细胞分析技术大事记
  来源:百世嘉    2016-12-31 10:32:47
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马上我们就要迎来2017年了,首先百世嘉祝您元旦快乐!


2016年,作为国内为数不多的细胞诊断公司,百世嘉取得了很多可喜的进展,我们自主研发的AmpliCellTMWGA单细胞全基因组扩增试剂盒和MycyteTM全自动荧光染色循环稀有细胞捕获仪推出,并初步获得市场的认可。当然,我们不仅仅是要告诉大家这个喜讯,除此以外,作为热门技术之一的单细胞分析领域这一年有哪些大事呢?小编特意整理了出来,一起看看吧!


正如世界上没有完全相同的两片树叶,世界上也没有两个相同的细胞,单个细胞都是独一无二的,它们在大小、蛋白质水平和所表达的RNA转录子方面都可能相差甚远。单细胞分析(Single Cell Analysis ,SCA)即是对单个细胞进行研究,研究单个细胞不仅可以很好的认识到细胞异质性,更好的对疾病进行解读,更有的时候,临床样本量及其有限,可供检测的细胞稀少,或者是有些细胞在血液和组织中的含量很少但却很重要,这些时候针对单细胞的分析就尤为关键。



细胞是我们人体的基础单位

 

单细胞分析技术飞速发展,这都多亏了分析工具的快速发展,如细胞分离、微流体、单细胞测序等。目前,单细胞分析的应用已涉及多个的领域,包括基础研究型应用,如癌症、免疫学、神经病学、干细胞等;临床应用,如无创产前诊断、体外受精、循环肿瘤细胞(CTCs)等。


单细胞分离和捕获

 

单细胞分析的第一步是细胞捕获和分离,单细胞的获取,最初是通过梯度稀释的方法,既繁琐也容易污染;随后通过显微操作方法,用类似注射器的装置分离单细胞,或激光捕获显微切割技术(LCM),然而可操作性并不强;再往后,流式细胞仪的分拣成为最常用的单细胞分离方法,但对环境要求过高;近年来微流控技术的发明,逐步成为研究者们的选择,不仅减少了昂贵试剂的使用量,节约了成本,还提高了操作效率和灵敏度。




2016年,火了半边天的强生CellSearch循环肿瘤细胞检测系统突然传出停止销售。对于CellSearch停产停售的原因,专业领域比较普遍的看法是认为其存在较明显的技术缺陷。循环肿瘤细胞也就是CTC总共有15个分型,强生只能检测到其中一个型别,漏检率很高。而且将找到的CTC分离出来,需要使用超显维仪器进行切割。而且切割出来的CTC也不能保持活性,也不能保证足够的数量和完整性。

 

老牌明星产品——Fluidigm公司C1 Single-Cell Auto Prep System——今年也依旧表现亮眼,C1可实现单细胞分离和NGS文库扩增一体化,一块C1芯片最多可以捕捉96个单细胞,随后,每个细胞在各自独立的反应室中依次完成裂解-反转录-扩增(以RNA-Seq为例)的步骤。但C1采用被动的细胞捕获方式,每个随液流经过捕捉位点的细胞以一定几率被截留。据C1的产品手册提供的数据推算,用户需准备至少六倍于捕捉位点数目的细胞并达到一定的浓度才可能取得理想的结果。在此之前,样品细胞还可能需要经过离心浓缩,并分出一部分来用于计数。因此,这种高损比的方式对处理微量样品还不够理想。 




对于微量的稀有细胞捕获,MycyteTM全自动荧光染色循环稀有细胞捕获仪开拓了另一种思路。MycyteTM是由百世嘉研发的基于标记物检测微流控技术的细胞捕获平台。通过微流控芯片、细胞识别软件、STR基因分型技术等独有技术组合,可实现高效率、高精度无伤害捕获,操作简便,方便研究者进行后续系列形态与功能方面的研究与检测。在胎儿有核红细胞捕获上表现的尤为出色。

 

单细胞测序技术

 

单细胞测序技术(Single-CellSequencing)是在单细胞水平对基因组进行扩增与测序的技术。



由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(一个典型的人类细胞仅含有约6.6pg DNA、10pg总RNA。),用传统的测序仪无法检测,所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增,同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种:简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR),多重置换扩增(MDA);和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。市场上有很多种扩增试剂盒,去年华大基因的研究人员在《GigaScience》发表了文章,利用7种试剂盒开展单细胞全基因组扩增,系统地比较了不同WGA方法的优点和缺点,尤其关注变异检测。结论是: 对于那些需要低重复率和高基因组覆盖度的研究,如疾病研究中的SNV检测, MDA和MALBAC策略比较合适。此外,如果同时开展SNV和CNV检测,他们建议使用MDA-2和/或MALBAC,因为它们在变异检测上的效率和准确性更高。不过,若有大量细胞需要扩增,成本是必须考虑的因素。MDA和DOP-PCR是最常用的全基因组扩增方法,成本相对较低。相比之下,MALBAC的成本要更高一些,且相对来说操作更为复杂。


今年,百世嘉自主研发了AmpliCellTMWGA单细胞全基因组扩增试剂盒,基于MDA技术原理,针对单个细胞,或者ng乃至pg级的少量DNA,进行全基因组无选择性,高覆盖度的有效扩增,微量基因样本扩增后可以达到85%以上的基因覆盖度,针对固定的单个细胞,可达到接近50%的扩增效率。广泛适用于二代测序,产前诊断,干细胞,肿瘤循环细胞,基因分型等多种下游应用。

 

今年金秋9月,Facebook首席执行官马克·扎克伯格与他的夫人普莉希亚·陈在旧金山令人瞩目地宣布:将在未来10年内投入30亿美元的巨额资金,资助科学家们攻克世界上最主要的疾病。该研究所宣布启动其第一个研究项目:将创建第一个庞大的人类所有细胞的目录,称为“细胞图谱(The Cell Atlas)”。“细胞图谱”的最终目的将是向世界各地的研究人员提供一个涉及所有细胞的目录,诸如控制管理大脑、心脏、乳腺、肾和肺等重要器官的众多不同类型的细胞。单细胞基因组学领域的技术进步,让科学家们可以从不同的组织和器官中分离单个细胞,并测量每个细胞的转录组或其他重要分子,在过去,测量这种复杂和广泛的信息几乎是不可能的。人体内的细胞有200种,包括像神经元细胞、心脏细胞、肌肉细胞等几大类。一个细胞的种类可以不断地往下划分,亚型下面还有亚型,仅视网膜组织就至少包括100种不同种类的神经元。更棘手地是,有些种类的细胞会在一定条件下转化为其他种类的细胞,并且每个亚型的细胞会根据不同环境呈现出不同的状态。这个计划非常具有野心,看起来也非常的庞大,希望2017年能看到新突破。

 


三代测序在单细胞测序中具有很大的优势,今年,国内外三代测序公司频获融资,北京希望组宣布完成近亿元人民币A轮融资,深圳市瀚海基因融资额已过亿。英国公司Oxford Nanopore Technologies宣布在最近一轮融资中获得了1亿英镑(合计1.26亿美元)融资,其MinIONs测序仪也宣布首次完成人类基因组测序。2月11日,基因测序领域的黑马10XGenomics宣布推出旗舰级测序新品Chromium,Chromium最为耀眼的功能是可以实现单细胞测序。

 

单细胞分析临床应用


 

在辅助生殖的临床应用中,结合了单细胞测序技术的胚胎植入前遗传诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和胚胎植入前基因筛查(preimplantation genomic screening,PGS),可以有效的避免试管婴儿的出生缺陷。我国在这一领域已经走在世界前列。PGD过程中,目前主要有三种方式获得活检材料:1)卵子的第一极体和第二极体;2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞);3)培养第5天左右的囊胚细胞。例如,牛津大学的Dr.Dagan Wells团队,通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序,选择健康的胚胎植入。另外,谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序,结合胚胎选择,选择正常的胚胎移植。今年二月份,国妇婴国内首位运用单细胞高通量测序联合核型定位技术对遗传性甲状腺癌致病基因RET进行筛检而生出的健康婴儿诞生。 


在癌症诊治的临床应用中,利用单细胞测序分析癌组织遗传物质的变化可以更加准确的诊断癌症发生的原因,为治疗提供更加精准的靶点信息。同时,利用单细胞测序技术分析血液中罕见的CTC遗传信息的变化,可以有效监测肿瘤的变化。



2016年1月,肿瘤免疫CAR-T疗法领军者之一的Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司:AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室,AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序,帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor)α和β链的基因的复杂性。传统的细胞免疫治疗在寻找结合靶点时也会忽略掉那些含量很低的靶点,然而最终可能就是这些被“平均掉”、“覆盖掉”的靶点,成为癌症复发转移的关键,正所谓“此消彼长”。Juno打算利用AbVitro的单细胞测序技术尽可能多的分析癌细胞上的靶点。从理论上讲,如果可以找到癌细胞所有的靶点,免疫疗法就可以干掉所有的癌细胞,这样就可以有效的避免癌症的复发转移。


美国加州理工学院华裔青年科学家蔡龙将CRISPR和单细胞成像相结合创造了MEMOIR方法,追踪通过CRISPR引入基因组的编辑更改。这个系统不仅能够被用来了解细胞谱系信息,而且也能够被用来了解这些细胞过去发生的事件---它们何时接收来自彼此的信息或者它们何时从一种细胞类型变成另一种细胞类型。比如,当肿瘤产生时,一些细胞可能接受来自其他细胞的不同分子信号,从而引发截然不同的命运。一种细胞可能变成转移性的和能够迁移,而另一种细胞保持静止不动。追踪过去的信号如何影响当前的细胞命运的能力可能为肿瘤的时空发育提供一种新的视角。 

 

单细胞分析技术飞速发展,目前来看,还处在初级阶段,我们相信:在单个细胞层面我们将以前所未有的水平理解基因组学,表观基因组学和转录组学的多样性,推动基础研究和临床研究的快速发展。

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